求助各位学霸,我在做聚丙烯酰氨凝胶电泳(EMSA)时,纯化的蛋白一直没有活性,什么原因?
蛋白没活性,主要是环境条件造成的,温度的高低,酸碱性等。但有一点,蛋白自身本来就没有活性也是有可能的。EMSA的原理是什么
一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异), 和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
扩展资料
由于很多研究的TF不具有结合的特异性,所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合,也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合,运用一些生物信息学 软件,可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况,发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。
同时,由于EMSA在体外不能模 拟细胞内众多生物分子的相互作用,比如,某一TF在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话,那么在体外是不能重现这一结果的。
参考资料来源:百度百科-EMSA (凝胶迁移)
emsa非标记探针的竞争结合后条带减弱了,但是不是特别明显
要知道自己要研究的转录因子的结合序列,之后按照结合序列的5'和3'端各加两个碱基(目的基因上的)就可以了。好像为了更稳定结合可以在两侧多加几个。 如果要设计突变的话就把突变点放在中间。 所知有限,希望能对你有所帮助emsa实验原理是什么?
EMSA实验的原理是基于DNA结合蛋白与DNA的特异性结合,依据实验需要,设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物。
通过电泳迁移率的变化来进行定性和定量分析,钟鼎生物提供的EMSA实验(凝胶/电泳迁移率实验)基于生物素标记探针与对应的DNA结合蛋白的特异性结合,设计合理、科学的实验方案,为客户提供验证性的EMSA,竞争性的EMSA以及超迁移EMSA(Super-shift EMSA)实验服务。
1、细胞核蛋白或纯化的转录因子,部分实验亦可使用重组表达的蛋白,依据实验设计每张膜至少提供50ul,浓度大于0.5mg/ml。
2、探针序列,如无探针序列,请提供DNA结合蛋白相关信息或相关文献,便于钟鼎生物技术人员设计探针。
3、结合蛋白特异性抗体50ul以上,浓度大于0.5mg/ml。